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Projet de thèse co-financé INRA-Région Bretagne 2010-1013

Titre : Effets de stress environnementaux sur la plasticité morpho-fonctionnelle des branchies chez les poissons: Rôles des corticostéroïdes.

Unité/équipe encadrante : INRA-SCRIBE, équipe Physiologie du stress et de l’adaptation, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes cedex.

Responsable scientifique : Patrick Prunet (HDR),
Co-directrices de la thèse : Isabelle Leguen, Violette Thermes

Contact : Patrick Prunet
Patrick.Prunet@rennes.inra.fr,
Tel 02.23.48.70.07/ 06.31.96.59.23

Contexte scientifique :
Les conditions de vie dans les élevages de truite font que les animaux sont exposés fréquemment à des situations de stress liées aux pratiques d’élevage (ex. manipulation du poisson) mais aussi à la qualité de l’eau d’élevage (paramètres très peu maîtrisables par l’éleveur). Ces stress ont des conséquences importantes sur la survie et le développement des œufs et des juvéniles/adultes. Une des premières réponses physiologiques à la plupart des situations de stress est une libération dans le plasma d’hormones corticostéroïdes comme le cortisol. Le cortisol, principale hormone contrôlant la réponse au stress chez les poissons, est aussi une hormone majeure pour la régulation de l’homéostasie ionique plasmatique qui peut être significativement perturbée suite à un stress (voir revues : Wendelaar Bonga, 1997 ; McCormick, 2001). Aujourd’hui, la compréhension des mécanismes de régulation de l’homéostasie ionique par les corticostéroïdes est très importante si on veut pouvoir décrire précisément les réponses au stress de l’œuf et du juvénile/adulte.
Le principal organe impliqué dans le maintien de l’homéostasie ionique plasmatique chez les poissons est la branchie. Cet organe présente une grande « plasticité » dans les différents types cellulaires présents dans cet épithélium et permettant au poisson de pouvoir mettre en place des mécanismes d’acclimatation, lors de stress environnementaux, afin de maintenir son homéostasie ionique plasmatique. Les données de la littérature suggèrent que ce phénomène de « plasticité » cellulaire repose, au moins en partie, sur un processus de prolifération et/ou de différenciation à partir de cellules précurseurs présentes au sein de l’épithélium branchial (Evans, 2005).
Récemment, il a été mis en évidence, chez la truite, la présence de plusieurs types de récepteurs aux corticostéroïdes et vraisemblablement l’existence de 2 ligands physiologiques pour ces récepteurs (voir revue Prunet et al., 2006) : le cortisol pour les récepteurs glucocorticoïdes (GR1 et GR2) et la deoxycorticostérone (DOC) pour le récepteur minéralocorticoïde (MR). Nos travaux confirment la présence de ces récepteurs dans la branchie de poisson ainsi que l’implication forte des GR dans la régulation des gènes des transporteurs ioniques branchiaux (Milla et al., 2007 ; Milla et al., 2009).
Au cours de l’organogenèse, les données de la littérature suggèrent que ces récepteurs et leurs ligands ont un rôle clé (Alsop et Vijayan, 2008 ; Prunet et al., 2009). Nos premiers résultats indiquent qu’ils peuvent contrôler la prolifération et/ou la différenciation des cellules épithéliales impliquées dans l’osmorégulation (Thermes et al, résultats non publiés).
Nous proposons donc d’étudier le rôle des complexes corticostéroïdes/récepteurs dans ces processus cellulaires dans l’embryon et chez l’adulte, par des approches complémentaires in vivo et in vitro.

Contexte agronomique :
Le développement durable d’une aquaculture en Bretagne, deuxième région piscicole française, impose la prise en compte des problèmes de bien-être des animaux d’élevage. La principale difficulté lorsqu’on aborde cette question chez des poissons en élevage est l’absence d’outils opérationnels pour évaluer le bien-être. La prédiction et la maîtrise des situations de stress, en particulier celles liées à la qualité de l’eau, constituent donc une préoccupation constante des éleveurs. Ainsi, l’évaluation de l’état de stress chronique chez les poissons reste très difficile et ne permet pas d’évaluer les conséquences des fluctuations de la qualité de l’eau sur l’état de santé des poissons. Le cortisol est la principale hormone libérée en réponse à des situations de stress chez les poissons mais c’est aussi une hormone impliquée dans l’osmorégulation, fonction physiologique très sollicitée au niveau de l’épithélium branchial lors de changement de la qualité de l’eau d’élevage. Les travaux que nous proposons sur le rôle des corticostéroïdes dans la régulation des mécanismes cellulaires branchiaux devraient nous permettre de mieux comprendre, et donc d’évaluer, l’impact de situations de stress sur la différenciation des cellules branchiales et donc les capacités d’acclimatation au milieu des poissons. Ces mécanismes de réponse au stress sont particulièrement importants chez les jeunes stades au cours de l’embryogenèse mais aussi chez les juvéniles et adultes confrontés à des changements de qualité d’eau.

Projet de recherche :
Ces processus de prolifération/différenciation seront étudiés in vivo dans différentes situations physiologiques : au cours de l’organogenèse branchiale et au cours de stress environnementaux tels qu’un transfert en eau de mer ou dans un milieu très pauvre en ions et aussi in vitro sur des cellules épithéliales branchiales de truite en culture primaire. Le projet se déroulera en 2 parties : Le travail envisagé sera réalisé sur la truite arc-en-ciel mais aussi chez le médaka, poisson modèle euryhalin sur lequel il est possible de réaliser des expériences d’inactivation génique (« knock-down ») impossibles chez la truite.

1) Etude in vivo de la régulation de la prolifération/différenciation des cellules épithéliales branchiales par les corticostéroïdes :
Nous proposons d’aborder la question suivante : Quels sont les rôles des MR et GR dans la prolifération/différenciation des cellules épithéliales branchiales au cours du développement embryo-larvaire et au cours du remodelage cellulaire qui a lieu lors de l’adaptation à un milieu hyper- ou hypo-osmotique ?
Chez le médaka, nous analyserons les niveaux d’expression des gènes GR et MR au cours du développement. Ensuite, nous étudierons les effets des morpholinos anti-GR, anti-MR mais aussi des ligands et des antagonistes de ces récepteurs sur la prolifération/différenciation des cellules épithéliales des branchies. L’étude de ces traitements sera aussi abordée au cours du transfert en milieu hyper- ou hypo-osmotique chez le médaka adulte.
Chez la truite, la même stratégie sera développée avec l’analyse de l’expression des gènes GR et MR au cours du développement, puis l’étude des effets des ligands et des antagonistes des récepteurs sur la mise en place des cellules épithéliales branchiales dans l’embryon. Les effets seront aussi étudiés chez les juvéniles de truites transférées d’eau douce en eau de mer ou eau désionisée. Les paramètres analysés seront à la fois l’expression de gènes clés de l’organogenèse, de l’osmorégulation, de la prolifération/apoptose et l’aptitude à osmoréguler.

2) Etude in vitro sur des cellules branchiales de truite en culture primaire :
Nous proposons d’aborder la question suivante : Quels sont les rôles des MR et GR dans la prolifération/différenciation des cellules épithéliales de branchies de truite en culture primaire ? En étudiant in vitro les effets des ligands et des antagonistes des récepteurs sur différents paramètres de prolifération/différenciation (marqueurs de prolifération, gènes ou protéines spécifiques des différents types de cellules épithéliales), nous pourrons aborder directement l’analyse des mécanismes régulés par les corticostéroïdes sans risquer d’interférer avec d’autres systèmes hormonaux ou nerveux.

Principales méthodes et techniques utilisées :
Knock-down d’expression génique avec des morpholinos.
Analyse de l’expression de gènes candidat par rtPCR et hybridation in situ.
Culture primaire de cellules branchiales.

Références.

Alsop D., Vijayan, M.M. 2007. Development of corticosteroid stress axis and receptor expression in zebrafish. Am. J. Physiol. 294: R711-R719.
Evans, D.H., Permarini, P.M., Choe, K.P., 2005. The multifunctional fish gill: Dominant site for gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation and excertion of nitrogenous waste. Physiol. Rev. 85c: 97-177.
McCormick, SD 2001. Endocirne control of osmoregulation in teleost fish. Am. Zool. 41: 781-794.
Milla, S. 2007. Etude du role physiologique du récepteur minéralocorticoide chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), implication dans la reproduction et l’osmorégulation. Thèse de doctorat l’Université de Rennes1.
Milla, P. Kiilerich, S., Sturm, A., Dengreville, L., Giton, J., Fiet, J., Prunet, P. 2009. Regulation of mineralocorticoid receptor gene expression after salinity challenges in rainbow trout (soumis pour publication).
Prunet, P., Sturm, A., Milla, S., 2006. Multiple corticosteroid receptors in fish : from old ideas to new concepts. Gen. Comp. Endocrinol. 147: 17-23.
Prunet, P., Kiilerich P., Milla S., Houeix B., Valotaire C., Guernec G., Leguen I. Mineralocorticoid receptor in fish: Appraisal of its osmoregulatory role. 16th Int. Congress Comp. Endocrinol., June 2009, Hong-Kong. pp.96.
Wendelaar Bonga, SE 1997. The stress response in fish. Physiol. Rev. 77: 591-625.